Одним из лучших стандартных методов, в которых используют­ся липоидные антигены, является рекомендуемая ВОЗ реакция VDRL. Название этой реакции происходит от заглавных букв учреждения, где она была разработана, – Venereal Diseases Research Laboratory в Атланте (штат Джорджия, США). Антиген для реакции VDRL вклю­чает 0,03 % кардиолипина, 0,9 % холестерина и 0,21 % лецитина. Его добавляют к инактивированной сыворотке больного, помещае­мой на предметное стекло, которое затем вращают в течение 4-5 мин при комнатной температуре и сразу регистрируют результат: наличие в сыворотке реагинов вызывает макроскопически види­мую флокуляцию. Реактоспособность сыворотки в реакции VDRL выявляется примерно через 4 нед после заражения сифилисом. Ко­личественную оценку циркулирующих антител получают путем раз­ведения сыворотки перед постановкой реакции в геометрической прогрессии: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Ложноположительные результаты (биологическая неспецифическая реактивность) могут обусловли­ваться аутоантителами при заболеваниях, протекающих с наруше­ниями иммунитета (красная волчанка, ревматизм, болезнь Шегрена, дисгаммаглобулинемия), а также при заболеваниях, связанных с усиленным разрушением клеточных ядер (малярия, пситтакоз, вирусная пневмония, карцинома). Главными достоинствами реак­ции VDRL являются низкая стоимость, легкость постановки, быс­трое получение результатов с довольно высокой чувствительностью и специфичностью, хотя и меньшей, чем в реакции с трепонем-ным антигеном.

Реакции иммунофлюоресценции.

Все большее значение для серологических исследований, особен­но при скрытом сифилисе и для распознавания неспецифических результатов стандартных серологических реакций, приобретают спе­цифические серологические реакции. К ним относятся РИФ и РИБТ.

Принцип РИФ основан на выявлении флюоресцирующих анти­тел, так как меченные флюорохромом антитела не теряют способ­ности соединяться с соответствующим антигеном и тем самым обус­ловливают свечение препаратов в сине-фиолетовых лучах, источни­ком которых является ртутно-кварцевая лампа.

РИФ в серодиагностике сифилиса начала применяться в нашей стране с конца 60-х годов (Беднова В. Н., 1977). Ее отличительной чертой, по сравнению со стандартными серореакциями, является более высокая чувствительность (поэтому она бывает положитель­ной у ряда больных уже в первичном серонегативном периоде сифилиса) при сохранении высокой специфичности. Однако, по мне­нию ряда авторов, РИФ уступает по специфичности РИБТ, хотя по технике постановки она значительно проще.

Реакция ставится в нескольких модификациях: РИФ-10, РИФ-200 и РИФ-абс. Считается, что РИФ-10 более чувствительна, а РИФ-200 и РИФ-абс – более специфичны. Реакция ставится не­прямым методом в 2 фазы. В первой фазе реакции на антиген нано­сится испытуемая сыворотка крови. Если в ней имеются соответ­ствующие антитела, то образуется комплекс антиген – антитело. Для выявления образовавшегося комплекса проводится вторая фаза реакции, при которой его обрабатывают меченной флюорохромом иммунной кроличьей сывороткой (против сывороточных глобулинов человека)

Полученный во второй фазе комплекс антиген – антитело опре­деляется с помощью люминесцентной микроскопии. Если свечения антигена нет, то это указывает на отсутствие в испытуемой сыво­ротке крови соответствующих антигену антител.

Наиболее ценной модификацией реакции иммунофлюоресценции является РИФ-200, основным назначением которой считается не ранняя серодиагностика сифилиса, а распознавание неспецифи­ческих результатов КСР и серодиагностика других форм сифилити­ческой инфекции, в том числе и скрытого сифилиса. При установ­лении излеченности сифилиса решающим является только отрица­тельный результат РИФ-200. Как и всякая другая серологическая реакция, РИФ-200 не обладает абсолютной специфичностью, по­этому вопрос о наличии или отсутствии заболевания должен ре­шаться на основании совокупности клинических, серологических и других данных.

Методика постановки РИФ-200. Кровь берут из вены в чистую и сухую пробирку в объеме 5 мл и обрабатывают как для реакции Вассермана. Инактивируют сыворотку однократно в тече­ние 30 мин при температуре 56°С. Хранят при температуре +4 °С или –20°С. Во время лечения больных пенициллином иногда могут быть получены ложноотрицательные результаты реакции, поэтому в этих условиях РИФ проводить не следует.

Антиген. В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-суточного орхита кролика. Получение и хранение антигена требует соблюдения условий сте­рильности, так как с одним и тем же антигеном реакция ставится в течение длительного времени. (Антиген может быть получен в ампу­лах из ближайшей лаборатории, где ставят РИФ). Перед каждой постановкой реакции взвесь хорошо перемешивают и исследуют в темном поле зрения для определения ее густоты. Для РИФ необхо­димо иметь 40-60 трепонем в темном поле зрения, и, если взвесь более густая, то ее разводят изотоническим раствором натрия хло­рида, (рН 7,2). Разводить надо только то количество антигена, ко­торое необходимо для постановки реакции.

Антивидовая флюоресцирующая сыворотка. В реакции необходима меченная флюорохромом сыворотка крови живот­ных, иммунизированных сывороточным белком человека. Лиофильно высушенную флюоресцирующую сыворотку растворяют при соблю­дении условий стерильности в дистиллированной воде, в том объе­ме, который указан на этикетке ампул, переливают в стерильную пробирку с корковой или резиновой пробкой и в процессе исполь­зования хранят в холодильнике при температуре –4 °С. В день поста­новки реакции нужное количество сыворотки разводят по титру дистиллированной водой. Титр каждой серии необходимо опреде­лять. Для этого берут 5 сывороток крови больных сифилисом и 5 сывороток здоровых людей, разводят их изотоническим раствором натрия хлорида в 200 раз и ставят реакцию с использованием во второй фазе различных разведении флюоресцирующей сыворотки против сывороточных глобулинов человека той серии, титр которой определяется. Окончательным титром можно считать тот, который проверен на 100 исследуемых сыворотках, из которых не менее 20 должно быть от больных сифилисом.

Техника постановки реакции. Из антигена готовят пре­параты на тонких, хорошо обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых обозначены кружки диаметром 1 см. За­паянным концом пастеровской пипетки круговыми движениями распределяют антиген в пределах кружка, и высушенный на возду­хе мазок фиксируют в течение 5 мин в чистом ацетоне. После фик­сации стекла помещают во влажную камеру. Инактивированные ис­пытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз изотоническим ра­створом натрия хлорида. Для проведения первой фазы реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят испытуемые сыворотки. Для того, чтобы покрыть препарат, достаточно 1 капли сыворотки. После этого влажную камеру закрывают и помещают в термостат при температуре 35°С на 30 мин. По истечении этого вре­мени препараты вынимают из влажной камеры, промывают в тече­ние 10 мин в двух порциях изотонического раствора натрия хлорида и помешают в штатив для высушивания. После высушивания пре­параты вновь помещают во влажную камеру и наносят по капле разведенной по титру флюоресцирующей сыворотки против глобулинов человека. Вторую фазу реакции проводят при комнатной тем­пературе, после чего препараты 10 мин промывают в изотоничес­ком растворе натрия хлорида, высушивают и монтируют для люми­несцентной микроскопии. Монтирование препаратов заключается в том, что на них стеклянной палочкой наносят маленькие капли забуференного глицерина (1 часть фосфатного буфера при рН 7,4 и 9 частей глицерина), накрывают их тонкими, хорошо обезжирен­ными предметными стеклами, на которые стеклянной палочкой наносят по капле нелюминесцирующее иммерсионное масло (диметилфталат). Исследование препаратов производят в люминесцент­ном микроскопе или в люминесцентном устройстве ОЙ-17. Степень свечения трепонем, зависящая от количества антител в сыворотке крови, обозначается плюсами. Свечение считается положительным, если его оценивают как 4+, 3+ и 2+.

Реакция иммунофлюоресценции-абсорбции с бледной трепонемой (FTA-ABS). Используемый для реакции антиген представляет собой взвесь бледных трепонем из пораженных сифилисом яичек кроли­ка, фиксированную ацетоном на предметном стекле. Можно также использовать лиофилизированные бледные трепонемы после их восстановления в изотоническом растворе натрия хлорида. Инакти-вированную сыворотку инкубируют с сорбентом (трепонемы Рей­тера) для абсорбирован ия неспецифических групповых антител. За­тем сыворотку помещают пипеткой на антиген, находящийся на предметном стекле. Специфические антитела (глобулины) связыва­ются бледными трепонемами. После промывания ктрепонемам на предметном стекле добавляют комплекс античеловеческого глобу­лина с флюоресцентным красителем (флюоресцеин-изотиоцианат). Этот комплекс связывается с человеческим глобулином на оболоч­ке клеток бледных трепонем и может быть идентифицирован мето­дом флюоресцентной микроскопии. По прошествии не менее 2 ч по степени флюоресценции сыворотку можно классифицировать как нереактоспособную, пограничную или реактоспособную. Реакция, обозначаемая двумя плюсами или больше, свидетельствует об ин­фекции.

Появления реактоспособности можно ожидать примерно в нача­ле 3-й недели после заражения, а у нелеченных больных она обна­руживается постоянно. Сыворотка остается реактоспособной и через несколько лет после успешного лечения раннего сифлиса, а у боль­ных, получивших адекватное лечение при позднем сифилисе, – на протяжении десятилетий. Главными достоинствами реакции FTA-ABS являются довольно высокая специфичность и чувствительность, а также быстро наступающая реактоспособность. Положительная FTA-ABS может иметь решающее значение для диагностики в сомни­тельных случаях, особенно при положительных реакциях VDRL или автоматизированной реакции микрогемагглютинации (АМНА-ТР), используемых для скрининга (LugerA., 1981).

Реакция 19S IgM-FTA-ABS. При идентификации антител IgM к бледным трепонемам реакцией FTA-ABS с использованием конъюгата анти-IgM в качестве реагента выявлялись ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Реакция 19S IgM-FTA-ABS в этом отношении является наиболее точным, специфичным мето­дом. В целях отделения крупных молекул 19S IgM от более мелких молекул 7S IgM используется методика ультрацентрифугирования, адсорбирования на белке А и гель-фильтрация с применением уль­трагеля АсА 34 с трисбуфером при рН 8,0 на колонке К 26/100 при объеме геля 300 мл, скорости потока 27 мл/ч и температуре 240 С. В этой системе первый пик элюата содержит фракцию 19S IgM. В процессе фильтрования отделяются непрочные иммунные комплек­сы. Использование фракции 19S IgM в реакции FTA-ABS обеспечи­вает высокую специфичность, устраняя возможность неспецифи­ческих, ошибочных результатов.

Реакция иммобилизации бледных трепонем.

Основное назначение РИБТ – распознавание ложноположительных результатов при постановке стандартных серологических реак­ций. Это особенно важно у больных, у которых отсутствуют клини­ческие проявления активного сифилиса или имеются поражения внутренних органов или нервной системы. Неоценима роль этой ре­акции для распознавания ложноположительных результатов стан­дартных серологических реакций у беременных, где от результата РИБТ фактически зависит судьба (здоровье) ребенка.

Сущность реакции заключается в потере подвижности бледными трепонемами в присутствии иммобилизинов испытуемой сыворот­ки и активного комплемента. Реакция ставится в условиях анаэро­биоза. Техника выполнения самой реакции довольно сложна, по­этому она ставится в специальных лабораториях.

Иммобилизины появляются в сыворотке крови больных позднее, чем другие антитела, и, следовательно, РИБТ становится положи­тельной позже, чем стандартные серореакции и РИФ.

Оценка реакции: при иммобилизации до 20 % бледных трепонем реакция считается отрицательной; при иммобилизации от 21 до 50 % бледных трепонем – слабоположительной; при иммобилизации от 51 до 100% – положительной (оценка процента иммобилизации бледных трепонем производится по специальной таблице).

Положительный результат РИБТ наблюдается у больных с тро­пическими трепонематозами (пинта, беджель). Иногда РИБТ дает ложноположительный результат при саркоидозе, эритематозе, ту­беркулезе, циррозе печени, атеросклерозе и др. С возрастом пациен­тов число ложноположительных результатов РИБТ увеличивается.

Упрощенная методика РИБТ (Методика разработана проф. Н. М. Овчинниковым.). Кровь для получения сы­воротки берут из вены стерильно в сухую чистую и простерилизованную посуду. Больной перед взятием крови не должен принимать никаких лекарственных средств, которые могли бы оказать вредное влияние на подвижность трепонем; в частности, необходимо пре­кратить введение дюрантных препаратов пенициллина на срок воз­можной задержки его в организме. Инактивация сыворотки произ­водится в течение 30 мин при температуре 56 °С, а если сыворотка была инактивирована накануне, то в день постановки реакции ее прогревают в течение 10 мин. Никаких консервантов в сыворотку не добавляют. При необходимости длительного хранения сыворотку можно заморозить при –20 °С. Сыворотки, высушенные на воща­ной бумаге (с добавлением свежеприготовленного 40 % пищевого сахара по 3 капли на каждые 0,5 мл сыворотки), можно в отдель­ных случаях применять для исследования. Следует, однако, учиты­вать, что титр иммобилизинов снижается при высушивании сыво­ротки подобно реагинам и при невысоких титрах снижение может быть значительным. Поэтому не следует широко пользоваться в РИБТ высушенными сыворотками.

Срок годности для исследования высушенной сыворотки 5 дней с момента приготовления в южных районах нашей страны или в жаркое время года и 10 дней – в остальных регионах. Сыворотка нативная, хранящаяся в холодильнике при температуре +3…+5°С, также теряет свою активность.

В качестве антигена применяют взвесь бледных трепонем из ран­него орхита кролика, зараженного сифилисом, обычно штаммом Никольса. Для заражения следует брать совершенно здоровых кро­ликов-самцов массой 2-2,5 кг, предварительно исследовав у них кровь на реакцию Вассермана. Отбирают только кроликов с отрица­тельными результатами серологических реакций. Заражение произ­водят внутрь яичка взвесью трепонем в количестве не менее 50-60 в поле зрения в объеме 0,50-0,75 мл. Непосредственно после зараже­ния кролику вводят внутримышечно 20 мг кортизона, а в последу­ющие дни – по 10 мг ежедневно. Рекомендуемое рядом исследова­телей одновременное рентгеновское облучение кроликов трудно для выполнения и не дает существенных преимуществ.

Для удаления яичка (при 6-8-дневном орхите) кролика привя­зывают к станку, обескровливают сердечной пункцией (некоторые предпочитают обескровливать через сонную артерию). Затем забива­ют кролика воздушной эмболией (введение 15 см3 воздуха в крае­вую вену уха). Яички выводят в мошонку путем поглаживания ла­донью по животу кролика сверху вниз. Поверхность кожи мошон­ки, предварительно немного подстриженной ножницами, смазыва­ют спиртом, поджигают, тут же тушат и опять поджигают. Этим достигаются освобождение кожи от шерсти и одновременно дезин­фекция кожи. После этого мошонку покрывают резиновой стериль­ной салфеткой с разрезом, через который выводят наружу яичко. Оператор фиксирует яичко одной рукой, а другой рукой делает скальпелем небольшой поперечный разрез кожи мошонки. Ножни­цами отрезают яичко от подлежащих тканей и помещают его в стерильную чашку Петри. Такого же рода манипуляцию проделыва­ют и с другим яичком. Далее ножницами удаляют придаток, осво­бождают яичко от жира и разрезают его на 10-15 кусочков. Готовят препарат с каплей изотонического раствора натрия хлорида и опре­деляют под микроскопом в темном поле наличие трепонем и их число. Все кусочки помещают в стерильную колбу объемом 50-75 мл, в которую уже налита среда (сыворотка кролика, разведенная 0,83 % стерильным раствором натрия хлорида, в количестве 10-14 мл на яичко). Колбу ставят в аппарат для встряхивания на 20-30 мин. После этого все содержимое выливают в большую стерильную центрифужную пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин для удаления плотных кусочков тканей. Затем надосадочную жидкость сливают и готовят препараты для микроскопии. Определяют число трепонем в темном поле зрения (окуляр 10, объек­тив 40). Если число трепонем большое, то взвесь следует развести, чтобы было по 10-15 трепонем в поле зрения, так как при большем их числе трудно подсчитывать иммобилизованные трепонемы.

Обычно в центрифужной пробирке над осадком оставляют не­которое количество жидкости и дают возможность немного ей постоять. Жидкостью, содержащей большое число трепонем, заража­ют кроликов для следующей постановки реакции. При каждой по­становке следует одновременно производить и заражение. Заражен­ных кроликов содержат в клетках в проветриваемом помещении при температуре +18…20°С. Пища кроликов должна содержать зна­чительное количество витаминов.

Для сохранения трепонем жизнеспособными предложено боль­шое количество различных сред (Овчинников Н. М., 1961).

Первоначально среда Нельсона была очень сложна. Затем Нельсон значительно упростил ее, но она все еще сложна. A. Bellone и М. Bonelli (1957) в качестве среды для сохранения трепонем применя­ют разведенную изотоническим раствором натрия хлорида сыворот­ку человека (2:1), а К. Meinike и К. Lagel (1959) – сыворотку кролика (2:1 или 1:1). Следует отметить, что трепонемы, взвешен­ные в одном изотоническом растворе натрия хлорида и особенно вместе с сывороткой больного и комплементом в небольшой дозе, выживают, судя по контрольным исследованиям, и без какой-либо среды, однако сроки их выживания значительно короче, подвиж­ность менее активна, и наблюдается значительное количество со­мнительных результатов.

Н.М. Овчинников (1961, 1962) предложил для РИБТ простую среду. Готовят 0,2% раствор пищевого желатина на 0,83 % растворе натрия хлорида. Раствор стерилизуют автоклавированием при тем­пературе 110°С в течение 10 мин, после чего добавляют стрептоми­цина сульфат из расчета 1:10000. Среда для опыта состоит из сыво­ротки кролика, разведенной 1:2 изотоническим раствором натрия хлорида, желатина и раствора человеческого альбумина. Альбумин готовят на изотоническом растворе натрия хлорида, стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр (пригоден только сухой альбумин, лиофильно высушенный); каждый раз при употребле­нии новой серии следует испытать, параллельно со старой, новую серию. Весь запас ингредиентов хранится в обычном рефрижерато­ре.

На 10 сывороток требуется 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина и 1,6 мл взвеси трепонем. Вымывание трепонем обычно производят разведенной кроличьей сывороткой, но можно с самого начала использовать указанную среду сохране­ния. Особенно следует обращать внимание на возможность у кроли­ков спонтанного спирохетоза, при котором могут наблюдаться по­ложительные результаты реакции или спонтанная агглютинация трепонем.

При хранении ингредиентов рН среды может меняться. В случае окисления среды к ней следует добавить 1 % стерильный раствор натрия гидрокарбоната до рН 7,2.

Реакция протекает только при условии избытка комплемента, поэтому применяют различные количества комплемента, что в зна­чительной степени зависит от примененной среды. При пользова­нии одной и той же средой установлено, что чем больше взято комплемента, тем больше находят иммобилизованных трепонем, а чем меньше комплемента, тем больше подвижных трепонем. При употреблении желатиновой среды оптимальное количество компле­мента равно 0,15 мл на каждую пробирку. Комплемент применяется свежий, полученный от морской свинки. Консервированный комп­лемент непригоден.

Техника постановки реакции. Пронумерованные пробирки с сы­воротками расставляют в штативе. В журнале нечетными номерами отмечают все смесители, в которые добавлялся активный компле­мент (опыт), и четными номерами – куда добавлялся инактивированный комплемент (контроль). Комплемент добавляют не для каж­дой сыворотки отдельно, а готовят «коктейль», т. е. предварительно соединяют комплемент с антигеном в нужных соотношениях для всех сывороток. Взвесь трепонем в питательной среде из расчета по 0,3 мл на каждую сыворотку делят на 2 части и добавляют в один флакон активный комплемент, а в другой – инактивированный.

В стерильный смеситель для лейкоцитов набирают сыворотку до метки 1. Конец смесителя стерильной ваткой вытирают от сыворот­ки, оставшейся на стенках. Это необходимо, так как при попадании положительной сыворотки в антиген в последующих сыворотках могут быть получены неверные результаты. Во избежание загрязне­ния при больших постановках разливают антиген параллельно в два флакона. После этого набирают взвесь трепонем с активным комп­лементом до метки 2. В другой смеситель набирают взвесь трепонем с инактивированным комплементом. Оба конца каждого смесителя закрывают резиновым кольцом, как для транспортировки крови, взятой для клинического исследования, и встряхивают для смеши­вания. (При отсутствии таких колец их можно сделать, разрезав полую резиновую трубку диаметром до 1 см вдоль и соединив кон­цы). Кольца до опыта и каждый раз после его проведения следует кипятить. Во избежание возможного влияния некоторых сортов ре­зины места ее соприкосновения со смесителем следует смазывать стерильным вазелиновым маслом. Можно не закрывать концы сме­сителя резиновыми кольцами, а заливать их парафином с темпера­турой плавления выше 50°С (парафин с более низкой температурой плавления непригоден, так как при помещении смесителей в тер­мостат парафин может стечь и герметичность системы будет нару­шена), однако это менее удобно. Благодаря тому, что оба конца смесителя закрыты, прекращается доступ воздуха, взвесь трепонем находится в относительно анаэробных условиях.

Для контроля набирают в те же смесители все взвеси с актив­ным и инактивированным комплементом, а также одну взвесь без комплемента. Ставят также реакцию иммобилизации с сыворотка­ми, заведомо отрицательными и заведомо положительными, остав­шимися от прошлой постановки.

Заполненные и закрытые смесители помещают в специальный штатив или коробку с вырезами. На каждый смеситель надевают нумерованные кольца из картона. Смесители помещают в термостат при температуре 35 °С на 18-20 ч. Для регистрации опыта через 18 ч смесители вынимают из термостата попарно – опыт и контроль.

Подсчет подвижных и неподвижных трепонем. По количеству сме­сителей в штативе расставляют и нумеруют маленькие пробирки (12х60 мм). Содержимое смесителя выливают в соответствующую нумеро­ванную пробирку, перемешивают тем же смесителем с надетой на него пипеткой и наносят каплю взвеси с активным комплементом на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону – с инактивированным комплементом той же сыворотки; посредине стекла ставят номер сыворотки. Капли накрывают покровными стеклами 20х20 мм. Капли должны быть небольшими, иначе трепонемы «плы­вут» с током жидкости, и тогда суждение об их подвижности и подсчет затруднительны. Учет результатов реакции начинают с инак-тивированного комплемента. Подсчитывают 25-30 трепонем и отме­чают, какое количество среди них подвижных и какое – неподвиж­ных. Если в контроле содержится меньше 17 подвижных трепонем из 25 сосчитанных, то такой опыт непригоден и его следует повторить. В пробирках с инактивированным комплементом отсутствие подвиж­ности трепонем объясняется не иммобилизацией, а токсичностью сыворотки или недостаточно высоким качеством среды сохранения (зафязнение бактериями, примесь медикаментов и т. д.).

При определении подвижности трепонем следует учесть, что дви­жения трепонем различны. Они могут обладать весьма активной подвижностью, особенно отчетливы сгибательные движения, а иног­да отмечаются только винтовые движения. Иногда трепонема лежит как бы неподвижно, но если присмотреться, то видно, что через некоторое время она начинает активно двигаться. Следует также уметь отличать активные движения трепонемы от движения с то­ком жидкости.

В пробирках, в которые вылили содержимое смесителей, в даль­нейшем определяют остаточный комплемент (во всех пробирках опыта и контроля). Пробирки с инактивированным комплементом служат как бы контролем для сравнения происшедшего гемолиза.

Расчет специфической иммобилизации производят по следую­щей формуле:

(Число подвижных трепонем в контроле – число подвижных трепонем в опыте) / Число подвижных трепонем в котроле х 100.

Реакция иммобилизации считается положительной, когда про­цент иммобилизации выше 51; от 31 до 50 % – слабоположитель­ной; сомнительной – от 21 до 30% и отрицательной – ниже 20 %.

Опыт с сомнительными, а иногда и слабоположительными ре­зультатами следует повторить; при этом можно получить или поло­жительный, или отрицательный результат. Неудовлетворительным считается результат, если имеется большое бактериальное загрязне­ние или отмечается токсичность сыворотки. Такие исследования сле­дует повторить с новой порцией сыворотки. Целесообразно также подвергать повторному исследованию все сыворотки, давшие пол­ное расхождение со стандартными серологическими реакциями. Эти сыворотки заслуживают особого внимания, так как в таких случаях результаты РИБТ могут дать опору для суждения о наличии или отсутствии сифилиса.

При постановке опыта обращают внимание на соблюдение сте­рильности и чистоты посуды. Она должна быть свободна от примеси веществ, могущих оказать вредное влияние на жизнеспособность трепонем. Смесители и всю посуду моют сначала холодной водой, затем горячей, споласкивают дистиллированной водой, не приме­няя никаких дезинфицирующих средств. Смесители стерилизуют в автоклаве, подсушивают в сушильном шкафу.

Описанная методика РИБТ достаточно проста и дает возмож­ность ставить реакцию иммобилизации всюду, где имеются квали­фицированный персонал и возможность содержать кроликов. Этот метод можно использовать также с другими питательными средами.

Реакция иммунного прилипания бледных трепонем (РИП) Приводится по методическим рекомендациям, составленным Г.П. Ав­деевой (Узбекский научно-исследовательский кожно-венерологический институт). основа­на на том, что вирулентные тканевые трепонемы, сенсибилизированные сывороткой больного сифилисом, в присутствии компле­мента и эритроцитов прилипают к поверхности эритроцитов и при центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.

Перед началом работы, связанной с приготовлением антигена из бледных трепонем, в кастрюлю объемом 2-3 л наливают на 2/3 дистиллированной воды и в процессе работы складывают в нее кол­бы, пробирки, пипетки, предметные стекла, загрязненные антиге­ном. Готовят также почкообразный тазик, заливаемый на 2/3 дис­тиллированной водой, куда складывают покровные стекла после работы. Приготовление препарата для подсчета бледных трепонем необходимо проводить с максимальной точностью, так как при неточном разливе ингредиентов, при избытке или недостатке ис­следуемого материала в препарате можно получить недостоверные результаты. Учет результатов следует проводить в день постановки реакции, лучше всего тут же после центрифугирования, так как при длительном стоянии пробирок (15-24 ч) возможны ложноположительные результаты. Покровные стекла должны иметь размеры только 24х24 мм. Надосадочную жидкость берут микропипеткой объе­мом 0,1 мл.

Для постановки реакции используются следующие ингредиен­ты: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты до­нора, изотонический раствор натрия хлорида. Кровь берут из вены и обрабатывают, как для реакции Вассермана. Сыворотку крови инактивируют в водяной бане при температуре 55-56°С в течение 30 мин.

В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штам­ма Никольса. Здоровым кроликам интратестикулярно вводят по 0,75-1 мл взвеси бледных трепонем, содержащей не менее 60-70 особей в поле зрения. На 7-12-й день кролика забивают воздушной эмболи­ей, вводя 20 см3 воздуха в ушную вену. Яички удаляют, очищают от оболочек, жира, освобождают от придатков и разрезают на мелкие кусочки, которые затем помещают в стерильную колбу, заливают 10-15 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Пос­ле этого всю жидкость из колбы отсасывают пипеткой в пробирку и определяют в ней число бледных трепонем. Для этого микропи-геткой из пробирки наливают 0,01 мл на предметное стекло, по­крывают покровным стеклом и смотрят в темном поле зрения. Если число бледных трепонем в поле зрения достигает 100, то в колбу с тканями яичка добавляют 50 мл, а если 50, то 20-25 мл стерильно­го изотонического раствора натрия хлорида и производят встряхи­вание в шюттель-аппарате в течение 50 мин. Первую порцию взвеси бледных трепонем уничтожают (она не может быть использована в качестве антигена). Вторую порцию жидкости, полученную при эк­страгировании, отсасывают стерильной пипеткой, разливают в хи­мические пробирки и снова определяют в ней число бледных трепо­нем в поле зрения. При наличии в этой порции жидкости 50-100 бледных трепонем яички можно подвергать повторным экстрагированиям с новыми порциями изотонического раствора натрия хло­рида до тех пор, пока в антигене не будет не менее 20 бледных трепонем в поле зрения. После каждого экстрагирования жидкость из колбочки отсасывают пипеткой в стерильные химические про­бирки и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин. Надо­садочную жидкость отсасывают (или сливают) из всех пробирок в одну стерильную колбочку, прогревают при температуре 56°С в те­чение 30 мин, и в ней определяют число бледных трепонем в тем­ном поле зрения, просматривая 10 полей зрения. Ампулирование производят сразу или на 2-3-й день после приготовления антигена. На ампулах с антигеном обозначают серию антигена, дату его изго­товления и среднее число бледных трепонем в одном поле зрения. Перед каждой постановкой РИП необходимо определять количе­ство бледных трепонем в антигене. Рабочий антиген должен содер­жать 15-20 бледных трепонем в поле зрения. Антиген применяется в дозе 0,3 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимо­го количества антигена делается в день постановки реакции. Напри­мер, для исследования 50 сывороток крови нужно 0,3х55, что в результате дает 16,5 мл рабочего антигена (поскольку необходимо взять на 5 пробирок больше с учетом контролей и случайных по­терь).