Репликация ДНК: учебное пособие

ДНК-полимераза ? связывает сначала матрицу, затем праймер и субстрат. ДНК-полимераза ? наиболее активна на двунитевой ДНК, содержащей бреши длиной не менее 20–30 н. Область связывания матрицы с ДНК-полимеразой ? является достаточно протяженной. Она строго защищает от гидролиза 9 н праймерной цепи, 13 н двухцепочечного участка и 14 н одноцепочечной матрицы и слабо защищает несколько оснований вне этого района. Фермент связывается с 19–20 н матрицы посредством ионных и гидрофобных взаимодействий, эффективность связывания при этом коррелирует с гидрофобностью оснований матрицы.

Отличительной особенностью ДНК-полимеразы ? является ее способность удлинять РНК-праймеры и прочная ассоциация с ДНК-праймазой, которая синтезирует эти праймеры.

Средняя процессивность ДНК-полимеразы ? составляет 20–50 н. Праймаза редко ошибается в момент синтеза динуклеотида, но затем легко использует неправильные NТР. Хотя скорость включения ошибочных нуклеотидов зависит от нуклеотидной последовательности матрицы и самого неправильного нуклеотида, в принципе, ДНК-праймаза является самым неточным нуклеотид-полимеризующим ферментом. В некоторых случаях один неправильный нуклеотид приходится менее чем на 100 правильных. Встраивание неправильного нуклеотида не препятствует включению следующего правильного нуклеотида. Праймаза может полимеризовать сходные нуклеотиды и генерировать праймеры с множественными ошибками, котрые не ингибируют дальнейший синтез и после внутримолекулярного переноса в ДНК-полимеразный активный центр удлиняются ДНК-полимеразой в присутствии dNTP.

Существуют две модели механизма синтеза праймеров, некомплементарных матрице. Согласно первой модели, фермент просто включает некомплементарные матрице нуклеотиды. Вторая модель предполагает включение нуклеотида, комплементарного матрице, с последующим скольжением праймера относительно матрицы. Низкая точность ДНК-праймазы послужила основой гипотезы о том, почему именно РНК является затравкой при репликации ДНК. Поскольку первые нуклеотиды могут ошибочно включаться в новую растущую цепь, предполагается, что РНК-праймер отмечает "высокоошибочный" участок для последующего вырезания и более точной застройки. Эта точка зрения выглядит убедительной, но, вероятно, главная причина появления РНК-праймера связана все-таки с более эффективной инициацией синтеза ДНК при наличии А-формы РНК-ДНК дуплекса.

В отличие от праймазы ДНК-полимераза ? является достаточно точным ферментом. Она делает в среднем от 1/30 000 до 1/50 000 ошибок. Важную роль в обеспечении специфичности синтеза играют белковые факторы репликации. В присутствии RРА точность ДНК-полимеразы ? повышается. Известно, что различие свободных энергий образования правильных и неправильных пар оснований в активном центре полимеразы, по-видимому, в 10 раз больше, чем в водной среде.

Выделенные из клеток высокомолекулярные формы ДНК-полимеразы ? могут обладать другими активностями помимо ДНК-полимеразной и праймазной. Эти комплексы представляют собой фрагменты репликативной машины клеток. В комплексе, осуществляющем репликацию лидирующей нити, ДНК-полимераза ? связана с ДНК-полимеразой ?, а в комплексе, синтезирующем запаздывающую цепь, – с ДНК-полимеразой ?. У эукариот оба комплекса связаны, вероятно, друг с другом в репликативной вилке подобно тому, как связаны холоферменты синтеза лидирующей и запаздывающей нити у прокариот. Об этом свидетельствует выделение из клеток человека комплексов, названных синтесомами и содержащих ДНК-полимеразы ?, ? и ?, а также ряд других репликативных белков, среди которых ДНК-праймаза, репликативный фактор RFC, РСNА, поли(АDР-рибозо) – полимераза и ДНК-лигаза I. Из этого высокомолекулярного комплекса недавно выделены и охарактеризованы ДНК-геликаза А с молекулярной массой 90 кДа и 5' -> 3'-экзонуклеаза с мол. массой 47 кДа. С ДНК-полимеразой ? может быть также связан белок Р1 из клеток мыши, являющийся гомологом белка МсмЗ дрожжей. Комплекс ДНК-полимераза ?-праймаза в ходе мейоза диссоциирует.

Большой Т-антиген SV40 (и других паповавирусов) взаимодействует с субъединицами р180 и р70 в комплексе ДНК-полимераза ?-праймаза и рекрутирует этот комплекс в ori вируса. При репликации вируса папилломы ДНК-полимераза ? связана с вирусной геликазой Е1.

Негативная регуляция комплекса в клеточном цикле зависит не только от фосфорилирования р180, но также от фосфорилирования субъединицы р68 циклинА-зависимыми киназами. В клетках дрожжей комплекс ДНК-полимераза ?-праймаза связан с хроматином в фазах G1 и S клеточного цикла, но не G2/М. Связывание с хроматином зависит от дефосфорилирования субъединицы 86 кДа (гомолог р70) в конце митоза.

ДНК-полимераза ? представляет собой гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы с мол массой 125–130 кДа и субъединицы 48–55 кДа, необходимой для связывания с фактором процессивности РСNА (proliferating cell nuclear antigene). Малая субъединица нужна для преодоления ферментом структурных барьеров в природных однонитевых матрицах. В действительности нативный фермент может представлять собой тетрамер, содержащий по две субъединицы с мол массами 125 и 55 кДа, а субъединица 55 кДа является фактором димеризации репликативных холоферментов, подобно субъединице ? в ДНК-полимеразе III Е. соli. В отсутствие РСNА ДНК-полимераза ? имеет низкую процессивность на длинных однонитевых матрицах, а в присутствии РСNA процессивность возрастает в 10-100 раз. С помощью делеционных мутантов установлено, что в ДНК-полимеразе ? мыши за связывание РСNА ответствен участок 129–149 аминокислотных остатков N-концевой области каталитического полипептида, С-концевой домен менее консервативен и содержит два участка связывания ДНК.

Холофермент ДНК-полимеразы ? включает в себя фактор процессивности РСNА и факторы RFС (replication factor C) и RРА, он собирается на праймер-матричном комплексе в следующем порядке: сначала RFС связывается с 3'-ОН-концом праймера на однонитевой ДНК-матрице, "покрытой" белком RРА. Затем RFС в присутствии АТР формирует на ДНК-дуплексе, прилежащем к 3'-концу праймера, кольцевую структуру из трех молекул РСNА с мол массой 36 кДа каждая, а РCNA обеспечивает присоединение ДНК-полимеразы ? к 3'-концу праймера, завершая таким образом формирование высокопроцессивного холофермента.

B самом РСNА идентифицированы участки, отвечающие за связывание с субъединицами RFС и ДНК-полимеразами. В присоединении к ДНК у полимеразы ? участвуют аминокислотные остатки 121–135, образующие петлю между доменами РСNА.

3'->5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы ? также регулируется факторами, входящими в состав холофермента. В отсутствие вспомогательных факторов 3'->5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы ? низка, но в присутствии белка RРА, как и ДНК-полимеразы ?, она возрастает в 8-10 раз. Активирующий эффект RРА на 3'->5'-экзонуклеазную активность обусловлен, очевидно, дестабилизацией комплекса затравки с матрицей в присутствии этого белкового комплекса.

Синтез ДНК-полимеразы ? в клеточном цикле регулируется на уровне транскрипции. Количество мРНК фермента и белка достигает максимума на границе G1/S-фаз. Динамика синтеза ДНК-полимеразы ? в цикле соответствует динамике ДНК-полимеразы ?. Интересно, что синтез РСNА в ходе клеточного цикла коррелирует с синтезом ДНК-полимеразы ?, однако содержание РСNА стабильно увеличивается и остается высоким до границы фаз G2/М. ДНК-полимераза ? представляет собой фосфобелок, наибольшая степень фосфорилирования которого относится к фазе S. Фосфорилирование каталитической субъединицы 125 кДа ДНК-полимеразы ? осуществляется, очевидно, специфичной для фазы G1 циклин-зависимой протеинкиназой сdk2. Интересно, что фосфорилирование каталитической субъединицы не сказывается на ее ферментативной активности.

ДНК-полимераза ? человека содержит два полипептида – каталитический 261 кДа и 55 кДа. ДНК-полимераза ? дрожжей состоит из пяти субъединиц: каталитической 256 кДа и субъединиц 80, 34, 31 и 29 кДа. Субъединица 80 кДа ДНК-полимеразы ? дрожжей является гомологом субъединицы 55 кДа фермента из клеток млекопитающих. Ферментативные активности – ДНК-полимеразная и 3'->5'-экзонуклеазная – связаны с высокомолекулярным полипептидом, N-концевой домен которого обеспечивает обе активности, а С-концевой домен необходим для контроля вступления клетки в S-фазу цикла.

Особенностью холофермента ДНК-полимеразы ? является его меньшая зависимость от вспомогательных факторов РСNА, RFС и RРА по сравнению с холоферментом ДНК-полимеразы ?. ДНК-полимераза ? способна процессивно удлинять затравку на однонитевых матрицах в отсутствие РСNА. В присутствии полного набора репликативных факторов увеличивается процессивность синтеза и эффективность связывания ДНК-полимеразы ? с праймерами. Существует представление, что на ДНК-матрицах, покрытых белком RРА, факторы РСNА, RFС и АТР образуют «комплекс узнавания 3'-ОН-конца праймера». Участок связывания ДНК-полимеразы ? в молекуле РСNА не совпадает с участком связывания ДНК-полимеразы ?. Об этом свидетельствует тот факт, что разные мутантные формы белка PCNA, синтезируемые штаммами рспа-79 и рспа-90, не способны взаимодействовать с ДНК-полимеразами ? и ? соответственно. В результате у мутанта рспа-79 нарушен синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой ?, а у мутанта рспа-90 – ДНК-полимеразой ?.

Другое различие между холоферментами ДНК-полимераз ? и ? заключается в разной скорости синтеза ДНК. В оптимальных условиях скорость синтеза ДНК холоферментом ДНК-полимеразы ? примерно на порядок ниже скорости синтеза холоферментом ДНК-полимеразы ?. Это различие связано с разной функцией ДНК-полимераз в репликативной вилке. Один холофермент ДНК-полимеразы ? осуществляет быстрый и процессивный синтез лидирующей нити, используя для элонгации единственный праймеру, синтезируемый в районе ori, и диссоциирует только по достижении конца репликона, а несколько холоферментов ДНК-полимеразы ? могут одновременно синтезировать фрагменты Оказаки в «зоне Оказаки», удлиняя праймеры, синтезируемые ДНК-полимеразой ?-праймазой в начале каждого фрагмента. При этом должен происходить быстрый оборот ДНК-полимеразы ?, сопровождающийся диссоциацией после завершения синтеза фрагмента и ассоциацией с праймером очередного фрагмента. При синтезе фрагментов запаздывающей цепи, когда концентрация праймеров высока и могут синтезироваться одновременно несколько фрагментов, скорость полимеризации менеее важна, чем спосбность к быстрому переключению с одного фрагмента Оказаки к другому.

Содержание мРНК ДНК-полимеразы ? в клеточном цикле изменяется, достигая своего максимума непосредственно перед клеточным делением. Уровень этой мРНК в пролиферирующих клетках в 5-16 раз выше, чем в покоящихся.

ДНК-полимеразы, ? и ?, обладают 3'->5'-экзонуклеазной активностью, выполняющей корректорскую функцию в ходе синтеза ДНК, но частоты ошибок при синтезе лидирующей и запаздывающей нитей отличаются. Это связано с тем, что часть ДНК отстающей нити синтезируется ДНК-полимеразой ?, которая способна синтезировать ДНК с большим количеством ошибок.

Эта полимераза локализована в митохондриях, ее функция связана с репликацией и репарацией мтДНК. ДНК-полимеразы ?представляют собой гетеродимеры, состоящие из большой каталитической субъединицы 125–140 кДа, обладающей ДНК-полимеразной и 3’->5'-экзо-нуклеазной активностью, и вспомогательной субъединицы 35–50 кДа, функция которой неизвестна. Как и другие ферменты репликации мтДНК, ДНК-полимераза ? кодируется ядерным геномом. Первичная структура ДНК-полимеразы ? сходна со структурой ДНК-полимеразы I Е. соli, особенно в области каталитических центров, в N-концевом 3'->5'-экзонуклеазном домене и С-концевом полимеразном домене.

Конец бесплатного ознакомительного фрагмента.